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Johanna stammte aus dem Haus Trastámara, einer Dynastie, die sich von Heinrich II. König von Kastilien und León (1369–1379), einem außerehelichen Sohn von König Alfons XI. († 1350), und durch diesen vom Haus Burgund-Ivrea ableitet. Es regierte seit 1126 die Königreiche Kastilien und León und lässt sich in Burgund bis in die erste Hälfte des 9. Jahrhunderts zurückverfolgen.
Unter den Enkeln Heinrichs II. teilte sich das Haus Trastámara in zwei Linien: Heinrich III. († 1406) wurde zum Stammvater der älteren Linie, der Könige von Kastilien und León, der Bruder Ferdinand I. († 1416) zum Stammvater der jüngeren Linie, der Könige von Aragón.
In Johanna vereinigten sich beide Linien, da sie väterlicherseits von der jüngeren Linie und mütterlicherseits von der älteren Linie des Hauses Trastámara abstammte. Ihre Mutter, Königin Isabella I., „die Katholische“ (* 22. April 1451, † 26. November 1504), regierte von 1474 bis zu ihrem Tode 1504 suo iure als Königin von Kastilien, León, Galicien, Asturien, Toledo, Sevilla, Córdoba, Murcia, Jaén, Gibraltar, der Kanarischen Inseln sowie seit 1492 auch als Königin von Granada und „Königin der Inseln und des Festlandes des Ozeans“ (der neu entdeckten Territorien in Amerika). Ihr Vater, König Ferdinand II., „der Katholische“ (* 10. März 1452, † 23. Januar 1516), regierte in eigenem Recht von 1479 bis 1516 als König von Aragón und als König von Sizilien, Neapel, Navarra, Korsika, Sardinien sowie seit 1492 auch als König von Granada und „König der Inseln und des Festlandes des Ozeans“, wobei er durch seine Heirat seit 1474 zusätzlich iure uxoris König der Territorien der Ehefrau bis zu deren Tode war. |